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簡體中文漏檢雜質，分析方法建立的大忌!！（超實用技巧，趕快收藏）
分析方法在藥學質量研究中扮演重要的角色，普析手段目前還是在分析領域占據重要的位置，一般尤以RP-HPLC-UV占比最大，一個好的分析方法能有效檢出樣品中存在的所有雜質，不遺漏某些雜質的檢出，以免誤導工藝人員正確的開發。
分析方法的建立往往在原料藥的質量研究中應用頗多，選擇合適的分析方法建立思路，快速過渡，以QBD思想快速篩選，以獲得最優的分析方法，對于質量研究尤為重要。以下是我在實際工作應用中對于方法建立等方面的一些心得。
分析方法建立的常規思路
仿制藥分析方法建立，一般有大量參考文獻，可以在文獻基礎上進行優化，事半功倍！
創新藥分析方法建立，一般參考文獻較少，在理論與經驗結合的基礎上快速建立方法！在RP-HPLC-UV建立之初，我們通常需要完成以下準備：
原料藥與雜質pKa判斷，以選取流動相體系最佳pH值。
流動相pH值一般選取pKa±2范圍之外，以保障化合物處于分子狀態，減少電離，此狀態下化合物疏水性較強，色譜柱保留時間較長，能獲得良好的峰型。
- 酸性化合物，可以選擇非緩沖的流動相進行pH調節，用單一的酸溶液（一般常用磷酸）進行色譜分離，酸的濃度應足以使pH值比需要值低的多。
- 堿性化合物，選擇是比較有限的，TEA/氨水可以用于調節到高的pH值，但是要求色譜柱能夠耐堿比較好。
2、流動相緩沖鹽選取
緩沖體系選擇的要求：能適當控制離子化、與檢測器兼容性、緩沖鹽溶液與有機相的互溶性、流動相的pH是否在色譜柱的安全范圍內。
常用的緩沖體系的鹽一般為磷酸鹽與醋酸鹽體系，其pKa見下表：
3、洗脫劑的選取
反相體系下，常用的洗脫劑為甲醇、乙腈與四氫呋喃。三種溶劑對比如下：
3、洗脫劑的選取
選擇性：α；柱效：N；保留因子：N
選擇性是影響分離度的最關鍵因素 ：
-
改變固定相
-
改變流動相
柱效是最容易預測和改變的因素；
最理想的保留范圍：1＜K＜10
b. 影響分離度的色譜條件
a. API與雜質溶解性
直接影響：雜質提取不充分，檢測結果不平行，重現性結果差！
間接影響：回收率波動較大，方法建立與方法驗證結果不匹配。
主成分在稀釋劑中的飽和溶解度，最好滿足飽和溶解度大于3倍的供試品濃度。
b. 靈敏度
檢測靈敏度不滿足，高濃度溶解性會有問題，濃度太大，峰拖尾影響檢測，易損壞色譜柱，在遺傳毒性雜質方法建立過程中尤為突出。
c. 酮式烯醇式互變
同一化合物有兩個響應接近的峰，主峰伴隨著一個較大的未知峰，峰有臺階，互變影響峰型。
具體可參考占小兵老師的“HPLC方法開發需注意的典型特殊結構化合物專題：酮式烯醇式互變”。
d. 溶劑效應
優先采用流動相體系，降低溶劑強度（如增加水相比例，調整pH等）。
e. 極性化合物弱保留
強保留型色譜柱（AQ色譜柱…..），離子交換色譜柱，離子對試劑， HILIC模式。
離子對試劑
- 酸性化合物：四丁基氫氧化銨、四丁基氯化銨、四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨等。
- 堿性化合物：烷基磺酸鹽類，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉等。三氟乙酸、五氟丙酸等全氟取代的直連有機酸等。
分析方法可靠性評估
防止漏檢雜質，最重要的就是需要進行分析方法可靠性評估，以判斷分析方法的適用性。
分析方法的建立，是一個系統的工程，在有參考文獻的條件下，需要評估方法的可靠性；線性洗脫程序的合理性，也是檢驗方法適用性重要的一環。
常規做法：
-
根據合成工藝路線及降解途徑分析可能產生雜質的全面性。
-
采用強制降解試驗來判斷方法的適用性。
-
延長梯度洗脫高比例洗脫劑洗脫時間，防止小極性雜質漏檢。
藥典方法不一定是最好的！
方法對比如下：
北京新領先雜質研究事業部，致力于原料藥注冊申報及雜質定向合成，通過雜質定向合成及雜質制備富集，獲取雜質對照品，解決藥物研究中雜質研究難點。通過制定有效的雜質研究和控制策略，降低質量研究工作量，縮短研發周期；創新分析方法，解決常規分析中分離與分析的難點，建立快速、穩定的分析方法。
雜質研究事業部由五個中心組成，分別為雜質對照品中心、質控中心、研發中心、工藝轉化中心和技術服務中心。分別對應于雜質定制、質量研究、工藝開發、工藝轉化和技術服務。部門內擁有Waters UPLC SQD2雜質純化系統、GilsonGX-281型制備系統、Agela快速純化系統、創新通恒LC6000制備系統、WatersSFCⅡ型餾分收集系統等。能快速富集雜質，根據MS信息，推測并獲得雜質結構，解決未知雜質來源、傳遞及控制策略。
雜質研究事業部成員均具有多年原料藥開發和雜質制備研究相關經驗，尤其在抗生素領域獲得很多研究成果。目前可提供滿足申報要求的原料藥研發和全套雜質定制服務，歡迎藥界朋友垂詢相關業務。
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